Autor: TURCHETTI-MAIA, A. L.

Orientador: MARES-GUIA, M.

Outros autores: MARES-GUIA, T.R. [DO/CNPQ]; RACIOPPI-BATISTA, C.; SANTORO, M.M.; MARES-GUIA, M.;;

Linhas de pesquisa no CNPq: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS / QUÍMICA DE MACROMOLÉCULAS

Unidade: INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Departamento: BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA

Palavras-Chave: INSULINA - ILHOTAS DE LANGERHANS - CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

A avaliação da viabilidade de ilhotas pancreáticas humanas para transplante é, normalmente, feita pelo método de ELISA, que determina a quantidade de insulina secretada sob um estímulo de glicose. Este ensaio é de difícil reprodução, levando a uma informação incerta sobre o potencial de sobrevivência das ilhotas após o transplante. O objetido deste estudo é tentar resolver este problema através do desenvolvimento de um simples, rápido e sensível protocolo para quantificar a insulina contida em extratos de ilhotas de Langerhans humanas utilizando RP-HPLC. Aproximadamente 500 ilhotas foram ressuspensas em 500 µL de etanol 65%, pH 3,0 e esta mistura foi submetida a um banho ultrassônico por 10 minutos, a 4oC. O extrato foi liofilizado e o pó mantido a -20oC por no mínimo um mês. No dia da análise, a amostra foi reconstituída em 500 µL de uma solução contendo 25,8% de acetonitrila e 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) e centrifugada por 5 minutos a 10.000 rpm. Uma alíquota de 50 µL do sobrenadante foi analisada em uma coluna RP-C8 a 35oC. A eluição ocorreu em um gradiente de acetonitrila de 15 minutos, com um fluxo de 1 mL/min e detecção a 214 nm. Este procedimento foi eficiente na purificação completa de insulina a partir de extratos de ilhotas. Análises em espectrômetro de massa da insulina eluída mostraram uma massa molecular de 5.797 Da. A quantificação da insulina foi feita utilizando-se um padrão de insulina recombinante e o limite de detecção foi de 8 picomoles. O total de proteínas do extrato foi determinado pelo método do ácido bicinconínico e os valores resultantes utilizados para estabelecer a proporção de insulina/proteína total. Em todos os lotes de ilhotas examinados, obtidos de 5 diferentes doadores de pâncreas sadios, a proporção insulina/proteína total por ilhota variou entre 1 e 3%.

Apoio: CNPq, CAPES, PADCT III, FAPEMIG, BIOMM S.A., Diabetes Research Institute.p>